Техніка виготовлення гістологічних препаратів

05.08.2015

ФІКСАЦІЯ МАТЕРІАЛУ

Загальні відомості. Сутність фіксації полягає в тому, щоб зберегти взяті шматочки органів і тканин від гниття і ферментативних процесів, що змінюють структуру тканин.

Фіксуються тканини зазнають ряд фізико-хімічних змін. Найбільш істотними з них є: швидке згортання білків і частково ліпоїдів і перехід їх у такий стан, при якому тканини не змінюються від тривалого зберігання і під час наступних обробок.

Фіксацію тканин виробляють в рідинах різного складу. Найбільш вживаними є формалін, спирт, рідше ацетон, сулема та ін

Фіксація формаліном. Продажний формалін (40%-ний водний розчин формальдегіду) застосовується в 10%-ном, 15%-ном розчині (10,0—15,0 продажного формаліну на 90,0—85,0 води). Формалін у зазначеній концентрації порівняно швидко (48— 72 год) просочує тканину і добре фіксує її. Не можна фіксувати матеріал в розчині формаліну більш високої концентрації або в нерозведеному продажному формаліні. В цьому випадку поверхневі шари тканини швидко ущільнюються, утворюють кірку, яка перешкоджає проникненню фіксуючої рідини всередину, де процеси аутолізу можуть продовжуватися.

У зв’язку з тим, що у формаліні завжди міститься певна кількість мурашиної кислоти, яка може чинити негативний вплив на тканину і перешкодити деяких методів подальшої обробки матеріалу (сріблення та ін) його слід нейтралізувати крейдою. На 100 г продажного формаліну (40%-ний розчин формальдегіду) додають Південь крейди. Вміст кілька разів збовтують, потім дають відстоятися, поки крейда осяде на дно посуду. Слід також мати на увазі, що при зберіганні формаліну в холодному приміщенні формальдегід здатен до .полімеризації і випадання з міцних розчинів у вигляді білих опадів. В цілях попередження цього рекомендують зберігати формалін в теплому приміщенні, у темному посуді.

Шматочки тканини, взяті для гістологічного дослідження, не повинні бути товще 0,5—0,7 див. Щоб шматочки тканини не щільно прилягали до стінок банки, їх кладуть на вату або фільтрувальний папір. Обсяг фіксуючої рідини повинен перевищувати приблизно в 10 разів обсяг взятого матеріалу. Фіксація водним розчином формаліну небажана в тих випадках, коли дослідження тканини має метою виявлення речовин, розчинних у воді.

У випадках, коли потрібне швидке дослідження, шматочки тканини фіксують у формаліні, нагрітому до 85-90° С. Тривалість фіксації шматочків товщиною 2-3 мм при такій температурі 10—15хв. При тривалому зберіганні матеріалу; у формаліні в фіксується тканини утворюються темно-бурі опади, які забруднюють препарати. Для видалення опадів рекомендується опускати гістологічні зрізи 2-3%-ний розчин перекису водню або 1%-ний розчин їдкого калі, потім їх декілька разів промивати водою.

Фіксація спиртом. Цей метод доцільний тільки в тих випадках, кргда необхідно зафіксувати в тканинах речовини, розчинні у воді і водних розчинах фіксаторів. Для фіксації застосовують спирт 95 або 100°. Спирт, дістаючи воду з шматочків тканини, сам розбавляється і робиться менш міцним. Тому рекомендується міняти спирт кілька разів. Шматочки тканини при фіксації спиртом повинні бути товщиною 2-3 мм. В зимовий час рекомендується застосовувати спирт-формалін (спирту 70°-90,0, формаліну 10,0).

ПРИГОТУВАННЯ ГІСТОЛОГІЧНИХ ЗРІЗІВ

Загальні відомості. Для виготовлення гістологічних зрізів фіксована тканина потребує додатковому ущільненні. Для цього існує декілька методів: заморожування тканини, просочування її целлоидином, парафіном і т. п.

Після фіксації і ущільнення тканини тим чи іншим способом готують зрізи. Для отримання тонких

Зрізів однакової товщини, придатних для макроскопічного дослідження, користуються особливими апаратами микротомами. Їх існує кілька типів. Найбільш вживаними є заморожують і санні микротомы (рис. 137). Принцип пристрою їх полягає в тому, що після кожного зрізу столик, до якого прикріплена досліджувана тканина, піднімається на задану висоту. Таким чином, зрізи виходять однакової товщини. Зріз повинен бути достатньо тонким і прозорим, зазвичай виготовляють зрізи товщиною від 4 до 15 м>км. Заморожування тканини. При виготовленні гістологічних препаратів тканина заморожують на замораживающем мікротоми, застосовуючи рідку вуглекислоту, ефір, хлорэтилен, або за допомогою електричного струму на столику з напівпровідників.

Шляхом заморожування тканини вдається досить швидко виготовити гістологічні препарати. Цей метод використовується також при дослідженні тканин на відкладення в них жиру та жировмісних речовин, оскільки жири розчиняються в спиртах, ксилолі та ацетоні.

Заливка тканини в целлоидин. Для заливки препаратів в целлоидин вирізають шматочки тканини товщиною 1-3 мм і послідовно проводять через спирти зростаючої фортеці — 50, 75, 95 і 100°, витримуючи по 24 год у кожному. Через спирт міцністю 100° шматочки тканини рекомендується проводити двічі, витримуючи по 24 год кожен раз. Потім шматочки тканини переносять в суміш рівних частин абсолютного (100°) спирту і ефіру також на 24 год. Після цього шматочки тканини поміщають спочатку в 2%-ний, а потім 8%-ний розчин целлоидина на 2-3 дні кожен.

Целлоидин готують з кіно — чи фотоплівки. Спочатку її відмивають від желатини в гарячій воді, потім просушують, дрібно нарізають і розчиняють в суміші з рівних частин спирту і ефіру. 2%-ний розчин целлоидина за консистенцією схожий з рідким колодієм, а 8%-ний нагадує густий сироп. Після витримки в густому целлоидине шматочки тканини заливають цим же целлоидином в чашечці під ковпаком, де він ущільнюється протягом 12-24 ч. Коли целлоидин придбає щільність еластичної гуми, вирізують блоки і наклеюють їх целлоидином на квадратні дерев’яні кубики. Можна заливати шматочки тканини целлоидином безпосередньо на кубиках. Влоки необхідно маркувати, для чого на одній з бічних поверхонь кубика роблять тушшю відповідне позначення. Зазвичай пишуть номер дослідження.

Зберігають шматочки, залиті в целлоидин, 70° спирті. Заливка тканини в парафін. Зневоднення тканини виробляють у спиртах висхідної фортеці у тому ж порядку, як і при; целлоидиновой проводці. Після витримки шматочків досліджуваної тканини у 100° спирті їх переносять в суміш рівних частин абсолютного спирту і ксилолу на 2-3 ч. Потім шматочки тканини заливають чистим ксилолом і витримують протягом 2 — 3 ч. По закінченні зазначеного строку їх переносять в новий чистий ксилол на 2-3 год, потім в парафін-ксилол (насичений розчин парафіну в ксилолі при 30° С) на 1 -1,5 год. Після цього шматочки тканини поміщають у чистий парафін при температурі 54— 56° С на 1,5—2 ч. Потім їх заливають парафіном в паперові або металеві формочки й охолоджують у воді. Ущільнені шматочки тканини, так само як і целлоидиновые блоки, наклеюють на дерев’яні кубики і маркують.

ФАРБУВАННЯ ЗРІЗІВ

Загальні відомості. Забарвлення гістологічних зрізів заснована на неоднаковому спорідненості тканинних елементів до певних барвників. Ядра клітин більш здатні забарвлюватися основними, а цитоплазма — кислими фарбами. Відповідно до цього розрізняють основні, або ядерні, і кислі, або дифузні, фарби.

Найбільш часто у звичайній ветеринарної патологоанатомічної практиці застосовуються забарвлення зрізів гематоксилін-еозином за Ван-Гизону, Перлсом, Суданом III і ін

Забарвлення гематоксилін-еозином. Фарбують зрізи в маленьких чашках Петрі або на склі. Цей метод застосовується для фарбування зрізів, приготованих будь-яким способом. При цьому ядра клітин набувають фіолетово-синій або густо-синій колір, а цитоплазма і волокниста речовина — світло-синій або рожево-червоний. Жири та липоиды не забарвлюються. Еритроцити ссавців, оскільки вони ядер не містять, забарвлюються тільки еозином.

Забарвлення зрізів в чашках Петрі роблять наступним чином.

1. Зріз переносять препарувальні голки з води в розчин гематоксиліну на 2-5 хв.

2. Промивають у воді 2-5 хв.

3. Занурюють на 10-20 с в 1%-ний розчин соляної кислоти на 70° спирті (якщо зріз сильно перефарбований гематоксилином, його слід тримати в цьому розчині трохи довше).

4. Промивають в чистій воді 5-10 хв.

5. Промивають в слаболужному розчині (в баночку з водою додають 1-2 краплі нашатирного спирту) 10 хв.

6. Промивають знову чистою водою протягом 10— 15 хв. Якщо зріз після лужної води недостатньо промитий, він погано опитується еозином.

7. Фарбують еозином протягом 3-5 хв.

8. Промивають протягом 1-2 хв водою. 280

9. Обезводнюють у спиртах висхідної фортеці— 75, 90, 100°. Якщо зріз перефарбований еозином, його слід трохи довше тримати в 75° спирті.

10. Прояснюють у карболксилоле.

11. За допомогою шпателя і голки зріз переносять на предметне скло.

12. Висушують фільтрувальним папером.

13. На зріз наносять краплю канадського або пихтового бальзаму і накривають покривним склом.

Забарвлення за Ван-Гизону. В зрізах, забарвлених за Ван-Гизону, сполучна тканина фарбується в яскраво-червоний, решта тканини в жовтий або сірувато-жовтий колір. Ядра забарвлюються в чорний або темно-фіолетовий колір.

Забарвлення роблять наступним чином.

1. Зрізи інтенсивно фарбують гематоксилином (краще гематоксилін Вейгерта) і споліскують у воді.

2. Відразу переносять у пикрофуксин на 3-5 хв (суміш насиченого водного розчину пікринової кислоти—150,0 і насиченого водного розчину кислого фуксину — 3,0—5,0).

3. Швидко промивають у воді (вода витягує з зрізу фуксин).

4. Зневоднюють 95° спиртом 1-2 хв.

5. Прояснюють у карболксилоле і укладають в ялицевий бальзам, як при забарвленні гематоксилін-еозином.

Забарвлення Суданом III. Судан III — нейтральна азокраска, розчинна у спирті, ацетоні і жирах, не розчинна у воді. Забарвлення Суданом III виробляють для визначення в зрізах жирів і ліпідів. Техніка фарбування наступна.

1. Заморожені зрізи переносять изводы на 0,5— 1 хв 50° спирт.

2. Зрізи поміщають в свежефильтрованный розчин Судану на 10-20 хв.

3. Споліскують 50° спиртом протягом 0,5—1 хв.

4. Ретельно промивають водою протягом 10 — 15 хв.

5. Зрізи підфарбовують квасцовым гематоксилином Ерліха або Бемера.

6. Промивають водою протягом 3-5 хв. Перефарбовані в гематоксилине зрізи диференціюють

В 1%-ном водному розчині соляної кислоти, споліскують подщелоченной водою, потім чистою водою.

7. Укладають гліцерин або гліцерин-желатину.

8. Накривають покривним склом. Забарвлення за Перлсом. Цей спосіб фарбування застосовують для виявлення в тканинах гемосидерину.

1. З дистильованої води зрізи переносять скляними голками на 15-20 хв у свіжоприготовлену суміш, що складається з однієї частини 2%-ного розчину жовтої кров’яної солі і півтори частин 1%-ного водного розчину соляної кислоти.

2. Промивають дистильованою водою протягом 5-10 хв.

3. Дофарбовували квасцовым карміном 15-20 хв.

4. Обполіскують у воді і проводять через спирти, карболксилол і бальзам.

Залізовмісний пігмент — гемосидерин — набуває синювато-зеленуватий або блакитний колір.

Забарвлення за Туревичу. За способом Туревича фарбують зрізи, виготовлені з мозку, для діагностики сказу. При цьому тільця Бабеша — Негрі і еритроцити зафарбовуються фуксином у червоний колір, нервові клітини гематоксилином — в синій.

Для гістологічного дослідження беруть шматочки аммонових роги і мозочка, фіксують їх у 10%-му формаліні, ацетоні або рідини Адуцкевича наступного складу: 80%-ної оцтової кислоти — 1 частина, хлороформу -2 частини, 96° етилового спирту — б частин.

Тривалість фіксації при кімнатній температурі у формаліні 1 добу, в ацетоні і рідини Адуцкевича — 3-6 год Після фіксації вирізають шматочки завтовшки не більше 1 -1,5 мм, заливають у парафін, після чого готують гістологічні зрізи, висушують і фарбують.

Забарвлення за Туревичу роблять наступним чином.

1. Зрізи перед фарбуванням депарафинируют в ксилолі 10-20 хв.

2. Змивають спиртом.

3. Фарбують ядра клітин гематоксилином Вей-герта протягом 2 хв.

4. Зрізи промивають водою.

5. Додатково фарбують 1 % — ним розчином

Кислого фуксину протягом 1 хв.

6. Промивають водою.

7. Диференціюють суміші 95° спирту і насиченого водного розчину пікринової кислоти в протягом 10-20 с до ясно-жовтого відтінку.

11. Укладають у канадський, або ялицевий бальзам.

Техніка виготовлення гістологічних препаратів

Короткий опис статті: гістологія препарати

Джерело: Техніка виготовлення гістологічних препаратів

Також ви можете прочитати