Спосіб приготування гістологічних препаратів

06.09.2015

Спосіб приготування гістологічних препаратів

Ми будемо вам дуже вдячні, якщо ви поставите «плюс один» в Google+ для української версії.

Автори патенту:

Булгакова Євгенія Сергіївна (UA)

Шацьких Ганна Вікторівна (UA)

Винахід відноситься до офтальмології, зокрема до способу приготування гістологічних препаратів. Спосіб приготування гістологічних препаратів включає підготовлення з щільної волокнистої оформленої сполучної тканини прямокутної смужки потрібного розміру, в якій формують кишеню, відповідний розмірами біоптату, приміщення біоптату в кишеню, стінки якого зшивають, і отриманий біологічний контейнер з біоптатів всередині поміщають у фіксуючий розчин формаліну, зневоднення в спиртах висхідної концентрації, просочування парафіном, заливки в парафін, приготування зрізів та фарбування. Вищеописаний спосіб дозволяє зберегти препарат у незмінному вигляді для дослідження.

Винахід відноситься до медицини, зокрема до офтальмології, і може бути використане для приготування гістологічних препаратів, отриманих у тому числі при микробиопсии (трепанобиопсии, инцизионной біопсії).

Відомі такі способи фіксації і приготування гістологічних препаратів (біоптатів):

— стандартний спосіб приготування гістологічних препаратів, описаний у навчальному посібнику «Гістологія», автори Єлісєєв В. Р. Афанасьєв Ю. І. Юріна Н.А. і інші, М. Изд-во: Медицина, 1983 р. с. 9-10;

— використання микрокассет з безліччю нумерованих відділень, кожне з яких укладається зразок. Потім поміщають в касету фіксуючий розчин (Use and rationale of a multicompartment microcassette for site-specific biopsies of the prostate in a consecutive cohort of men / M. E. Laniado, I. McMullen, M. M. Walker, A. Patel // Prostate Cancer and Prostatic Diseases. — 2003. — Vol.6. — P. 50-52);

— укладання зразка на згин паперового контейнера між двома шарами паперу або іншого пористого матеріалу, з подальшим приміщенням паперового контейнера у фіксуючий розчин (Удосконалення методики дослідження толстоигольных біоптатів передміхурової залози / А. В. Урбанський, А. Б. Маркочев, А. Ю. Плеханов та ін // Архів патології. — 2005. — №2. — С. 50).

Кожен з перерахованих способів, звичайно, має свої плюси, разом з тим, жоден з них не позбавлений недоліків. А точність постановки діагнозу та отримання об’єктивних результатів у дослідницькій роботі при мікроскопічному дослідженні в чому залежать від адекватності отримання біоптату і якості його (гістологічних препаратів) виготовлення. Часто розміри біоптату дуже малі, що викликає труднощі в процесі підготовки мікропрепаратів, зокрема, на етапі дегідратації тканинних об’єктів. Проблеми пов’язані з втратою микропрепарата ще до початку гістологічної проводки, так, після фіксації біоптат вміщують у марлеві мішечки, через широкі отвори яких невеликі фрагменти біоптатів випадають; під час зневоднення і знежирення біоптатів вони втрачають свою форму, значно зменшуючись у розмірах, сморщиваясь і розпадаючись на окремі клітини, що призводить до неможливості постановки діагнозу або помилкового діагнозу, тобто неинформативности настільки малого за розмірами біоптату.

матеріали, що Використовуються для поліпшеної проводки біоптатів не володіють пластичністю і вимагають в подальшому, на різних етапах гістологічного дослідження, вилучення з них матеріалу (біоптату) для подальшої обробки та огляду, що представляє технічно складно осуществимую завдання зважаючи дрібних розмірів біопсійних матеріалів і є більш трудомістким процесом.

В якості прототипу нами обраний стандартний спосіб приготування гістологічних препаратів, описаний в навчальній літературі «Гістологія», автори Єлісєєв В. Р. Афанасьєв Ю. І. Юріна Н.А. і інші, М. Изд-во: Медицина, 1983 р. с. 9-10.

Спосіб включає в себе такі основні етапи: взяття матеріалу і його фіксація, зневоднення і ущільнення (заливання в парафін) матеріалу, приготування та фарбування зрізів.

Завданням винаходу є створення нового способу приготування гістологічних препаратів.

Технічним результатом винаходу є забезпечення збереження вихідного положення зразка від моменту різання до приготування зрізів, виключення можливості втрати біоптату або його дезорієнтації, а також відсутність пошкодження леза микротома при виготовленні зрізів.

Технічний результат досягається тим, що в способі приготування гістологічних препаратів, що включає забір біоптату, фіксацію в 10% розчині формаліну, зневоднення в спиртах висхідної концентрації, просочування парафіном, заливки в парафін, приготування зрізів і фарбування, згідно винаходу з попередньо підготовленою щільної волокнистої оформленої сполучної тканини вирізують прямокутну смужку необхідного розміру, в якій формують кишеню, відповідний розмірами біоптату, і після забору поміщають біоптат в кишеню, стінки якого зшивають, і отриманий біологічний контейнер з біоптатів всередині поміщають у фіксуючий розчин, піддаючи послідовним етапам обробки аж до приготування та фарбування зрізів.

Доцільність даного способу обумовлена тим, що щільна волокниста оформлена сполучна тканина, така як склера, тверда мозкова оболонка, сухожилля, є доступним матеріалом, який не являє собою перешкоди на етапі дегідратації, так як є тканинної органічною структурою, що в ній відсутня клітинний матеріал. Запропонований біологічний контейнер з біоптатів всередині являє собою щільну тканину, через яку не можуть зникнути дрібні фрагменти тканини. Будучи фіброзною тканиною з чіткою безклітинній морфологічною картиною, що використовується біологічний контейнер з біоптатів всередині створює природний контраст з іншими досліджуваними тканинами. Крім того, його використання не потребує в подальшому вилучення з неї досліджуваних зразків (біоптатів).

Спосіб здійснюється наступним чином: попередньо з імплантату, активно використовується в офтальмології для склеропластики, представленого щільної волокнистої оформленої сполучної тканиною, такий як склера, тверда мозкова оболонка, сухожилля (Гістологія. Єлісєєв В. Р. Афанасьєв Ю. І. Юріна Н.А. М. Изд-во: Медицина, 1983 р. стор 181-183), вирізують прямокутну смужку з допомогою леза або конъюнктивальных ножиць, необхідного розміру, в якій расслаивателем або лезом формують кишеню, відповідний розмірами біоптату, і після біопсії (нами виконувалась біопсія придаткового апарату ока і ретробульбарного простору) гістологічний матеріал, біоптат, поздовжньо укладають в кишеню імплантату, стінки якого зшивають одним вузловим або П-подібним швом, і отриманий біологічний контейнер з біоптатів всередині поміщають у фіксуючий розчин (10% розчин формаліну) на 24 години. Після фіксації контейнер з біоптатів промивають проточною водою протягом декількох годин, і в такому вигляді контейнер з біоптатів проходить наступні етапи гістологічної обробки:

зневоднення — «проводять» по батареї розчинів етилового спирту із зростаючою концентрацією: 70%, 80%, 96% і 100%;

заливання в парафін (ущільнення): контейнер з біоптатів поміщають в ксилол-парафін, потім в рідкий парафін на 1 годину при 56°C, після охолодження і затвердіння парафіну вирізають блоки з укладеними контейнером з біоптатів і закріплюють на дерев’яній кубику;

приготування зрізів здійснюється мікротомом, попередньо закріплюючи кубики на объектодержателе. Потім за допомогою подаючого пристрою объектодержатель разом з кубиком переміщається за кожен крок на фіксовану відстань 3-5 мкм. Микротомный ніж зрізає з парафінового блоку шар — зріз — заданої товщини. Після чого зрізи поміщають на поверхню теплої води для їх розправлення, а потім на предметне скло;

фарбування: перед фарбуванням зрізів видаляють ущільнюючу середу, звільняють від парафіну (депарафинизация) з допомогою спиртів(100%, 96%, 80%,70% і 60%) і потім з допомогою фарбування гематоксилином та еозином досягають контрастності досліджуваного гістологічного препарату.

Таким чином, отриманий біологічний контейнер з біоптатів всередині проходить всі етапи стандартної гістологічної обробки, аж до виготовлення зрізів і фарбування, не витягуючи біоптату, повністю зберігаючи вихідне положення гістологічного препарату, виключаючи можливість його втрати, не викликаючи ускладнень при постановці діагнозу. Для ілюстрації заявленого способу наводимо наступні клінічні приклади.

Приклад 1. Хворий М. 42 років, звернувся зі скаргами на випинання і відхилення досередини лівого ока. Проведена комп’ютерна томографія: у лівій орбіті виявлено новоутворення. Гострота зору лівого ока 0,7 не коригується. Праве око здоровий.

В умовах операційної, після традиційної обробки операційного поля і місцевої анестезії виконали пункцію ретробульбарного простору лівої орбіти за допомогою напівавтоматичного трепана діаметром 1,2 мм (18G) і виїмкою для взяття біоптату до 20 мм, в результаті забору матеріалу отримали біоптат розміром 7?1 мм. Отриманий біоптат піддали запропонованого способу приготування гістологічних препаратів: попередньо з імплантату — склери — з допомогою леза вирізали прямокутну смужку розміром 10?7 мм, в якій расслаивателем сформували кишеня розміром (8?1,5 мм), і після біопсії біоптат з допомогою леза і пінцета акуратно, не розтягуючи його, з виїмки відкритої голки знімали і поздовжньо укладали в кишеню імплантату, стінки якого пошили П-подібним швом, і отриманий біологічний контейнер з біоптатів всередині помістили у фіксуючий розчин 10% розчину формаліну на 24 години і в такому вигляді контейнер з біоптатів піддали стандартним етапами гістологічної обробки, не витягуючи біоптату аж до фарбування зрізів, зберігаючи вихідне положення гістологічного препарату. При гістологічному дослідженні встановлено діагноз гострого васкуліту орбіти. Хворий отримував відповідне даного діагнозу лікування з позитивним ефектом.

Через 2 роки після лікування: гострота зору лівого ока 0,9 не коригується. Рецидивів захворювання за зазначений строк спостереження не було.

Приклад 2

Хворий Б. 3 років, поступив в клініку з діагнозом: Новоутворення лівої орбіти. Проведена комп’ютерна томографія: у лівій орбіті виявлено новоутворення. За місцем проживання була виконана біопсія, неінформативна з-за малого розміру отриманого біоптату.

Нами в умовах операційної, під наркозом, враховуючи вік пацієнта, після традиційної обробки операційного поля виконана пункція ретробульбарного простору лівої орбіти за допомогою напівавтоматичного трепана діаметром 1,2 мм (18G) і виїмкою для взяття біоптату до 20 мм, в результаті забору матеріалу отримали біоптат розміром 8?1 мм. Отриманий біоптат піддали запропонованого способу приготування гістологічних препаратів: попередньо з імплантату, представленого твердою мозковою оболонкою, з допомогою леза вирізали прямокутну смужку розміром 12?7 мм, в якій расслаивателем сформували кишеня розміром 9?2 мм, і після біопсії (нами виконувалася трепанобіопсія ретробульбарного простору) біоптат з допомогою леза і пінцета акуратно, не розтягуючи його, з виїмки відкритої голки знімали і поздовжньо укладали в кишеню імплантату, стінки якого пошили П-подібним швом, і отриманий біологічний контейнер з біоптатів всередині помістили у фіксуючий розчин 10% розчину формаліну на 24 години і в такому вигляді контейнер з біоптатів піддали стандартним етапами гістологічної обробки, не витягуючи біоптату аж до фарбування зрізів, зберігаючи вихідне положення гістологічного препарату. В результаті при гістологічному дослідженні встановлено діагноз-ембріональна рабдоміосаркома, для підтвердження діагнозу отриманий матеріал піддавався додатковому дослідженню — імуногістохімічне дослідження, діагноз підтвердився.

В результаті пацієнту було проведено відповідне комбіноване лікування (поліхіміотерапія з наступним опроміненням орбіти) з позитивним ефектом.

Паралельно, виконуючи додаткову трепанобиопсию, ми піддали отриманий біоптат стандартним способом приготування гістологічних препаратів, взятому за прототип. В результаті на етапі зневоднення біоптат втратив вихідну форму, значно зменшився в розмірах, створюючи труднощі на інших етапах приготування, так як препарат став менш помітним і виникала можливість його втрати. У підсумку біоптат виявився малоінформативним і не дозволив сформулювати точний діагноз.

Таким чином, використання заявленого нами способу дозволило зберігати біоптат у вихідному положенні, не пошкоджуючи його структури і форми, не порушуючи його цілісності, що значно підвищило інформативність отриманих гістологічних зрізів препаратів і підвищило точність встановлення діагнозу.

Спосіб приготування гістологічних препаратів, що включає забір біоптату, фіксацію в 10% розчині формаліну, зневоднення в спиртах висхідної концентрації, просочування парафіном, заливки в парафін, приготування зрізів і фарбування, відрізняється тим, що попередньо з підготовленої щільної волокнистої оформленої сполучної тканини вирізують прямокутну смужку необхідного розміру, в якій формують кишеню, відповідний розмірами біоптату, і після забору поміщають біоптат в кишеню, стінки якого зшивають, і отриманий біологічний контейнер з біоптатів всередині поміщають у фіксуючий розчин, піддаючи потім послідовним етапам обробки аж до приготування та фарбування зрізів.

Короткий опис статті: гістологія препарати Винахід відноситься до офтальмології, зокрема до способу приготування гістологічних препаратів

Джерело: Спосіб приготування гістологічних препаратів

Також ви можете прочитати