Спосіб фарбування гістологічних препаратів

16.09.2015

Спосіб фарбування гістологічних препаратів

Вледельцы патенту:

Дагестанська державна медична академія

Винахід відноситься до медицини, а саме до гістології, може бути використано при морфологічних дослідженнях в патологічній анатомії, цитології, судової медицини. Спосіб включає проводку матеріалу за гістологічною батареї і заливки в парафін, потім пересадку на блоки. На мікротоми виготовлені серійні гістологічні зрізи, нанесені на предметні скла. Після депарафінізації в ксилолі препарати перенесені спочатку в 95 o. потім у 70 o спирт, після чого споласкивали у 2 порціях дистильованої води. На зрізи нанесені по 2 краплі 2%-ного розчину солі міцного синього ББ. Через 5 хв розчин зливали і наносили по 2 краплі того ж розчину і по 2 краплі барвника (склад барвника: 0,6 г метилового зеленого і 0,4 г пиронина G змішували в 20 мл аптечного гліцерину і 80 мл дистильованої води). Зрізи фарбували протягом 5 хв, після чого ополаскивали у 2 порціях дистильованої води і сушили фільтрувальним папером. Для диференціації ядер використовували 2 зміни 96 o етилового спирту. Укладали препарати в канадський бальзам, попередньо просветляя за 5 хв в бюксах з мета-ксилолом. Спосіб забезпечує стабільне забарвлення клітин і клітинних структур, дозволяє коригувати інтенсивність фарбування різних структур без шкоди для якості гістологічних препаратів.

Винахід відноситься до медицини, а саме до гістології, може бути використано при морфологічних дослідженнях в патологічній анатомії, цитології, судовій медицині.

Існує кілька способів виявлення ДНК і РНК в клітинах за допомогою фарбування гістологічних препаратів метиловим зеленим і пиронином (Паппенгейм, 1899; Унна-Паппенгейм, 1903; Браше, 1942; Треван і Шаррок, 1951; Ліллі, 1954; Курник, 1952, 1955 та ін).

Зазначені методи вимагають застосування значної кількості різних реактивів (ацетатного буфера, бутилового спирту, ацетону, фенолу і т. д.), що здорожує процедуру фарбування, досить тривалі за часом і не забезпечують стабільну якість фарбування.

зокрема, метод Унна-Паппенгейма, який може бути з повною підставою рекомендований для чисто гістологічних цілей (Меркулов Р. А. Л. 1969, с. 275-279), має ряд недоліків: 1) фіксація тканин вимагає застосування спеціальних фіксуючих сумішей (рідину Карнуа, суміш абсолютного спирту з крижаною оцтовою кислотою (1:1) і т. д.); 2) відносно велика і невизначена тривалість часу фарбування в суміші — від 15-20 хв до 1-2 год; 3) недостатньо елективна забарвлення ядер і відсутність стандартності фарбування пиронином; 4) небажана екстракція метилового зеленого або пиронина при обполіскуванні та зневоднюванні; 5) використання розчинів карболової кислоти (фенолу) для приготування суміші барвника.

Аналогом пропонованого способу є метод Браше (1942), описаний в «Гистохимии» Е. Пірса (М. 1962, с. 745).

Цей метод має також ряд недоліків: 1) суміш барвника зберігається відносно недовго (близько 1 тижня); 2) невизначено час фарбування — від 10 хв до 24 год, що вимагає конкретного вибору часу для кожного випадку забарвлення; 3) при обполіскуванні в дистильованій воді вимивається пиронин (тому потрібно проводити процедуру обережно і дуже швидко, що вимагає великого досвіду); 4) зневоднення в абсолютному ацетоні, потім у 2-х порціях суміші абсолютного ацетону і ксилолу (знову-таки потрібно проводити процедуру швидко і обережно, т.к. відбувається швидка екстракція барвників з препарату);

5) висновок дистрен-дибутилфталат-ксилол (препарати погано зберігаються при укладанні в канадський бальзам);

6) можлива формалінова фіксація, але короткочасна (4-16 год). Тому при необхідності неможливо зберігати фіксовані препарати, бо після тривалої формаліновою фіксації забарвлення за методом Браше дає погані результати;

7) необхідність використання М/5 ацетатного буферу з рН 4,8.

Доктор Дьердъ Киселі («Практична микротехника і гистохимия», Будапешт, 1962, с. 199) пропонує метод фарбування метиловим зеленим і пиронином розчином Тафта, що складається з 0,5 г метилового зеленого і 0,2 г пиронина в 100 мл 0,1 М ацетатного буферу з рН 4,4. Час фарбування 10 хв. Однак промивка і зневоднення проводиться спочатку в суміші абсолютного спирту і терциерного бутилового спирту, потім дворазово в сменяемом терциерном бутиловому спирті.

Недоліками даного методу ми вважаємо необхідність застосування в суміші барвника ацетатного буферу з певним рН і терциерного бутилового спирту. Останній, як вказує автор, досить часто потрібно змінювати і при низькій температурі повітря в лабораторії він набуває щільну консистенцію, внаслідок чого виникає необхідність розплавити його в термостаті. Крім того, забарвлення потрібно проводити при суворому дотриманні строків та у контрольованих умовах (розчин Тафта зберігається недовго).

МЕТОД КУРНИКА (1952, 1955) має деякі переваги перед вищеописаними. В «Патогистологической техніки і практичної гистохимии» Р. Ліллі (М. 1969, с. 146) описаний початковий варіант, запропонований Курником в 1952 р. (Kurnick, Stain Techn. 25, 233, (1952)). У цьому варіанті фарбування 0,2%-ним розчином метилового зеленого в 0,01 М ацетатном буфері з рН 4,2 проводиться роздільно, потім, після зневоднення, в двох змінах н-бутилового спирту фарбується насиченим або розведеним свіжоприготованим розчином пиронина В ацетоні до уникнення екстракції пиронина при зневодненні і обробці дифференцирующими метиловий зелений агентами.

Недоліки:

1) метод вимагає використання спеціальних фіксаторів (суміш Карнуа, холодний ацетон і ін);

2) використання ацетатного буфера;

3) необхідність зневоднення тільки в н-бутиловому (або трет-бутиловому) спирті;

4) роздільне фарбування метиловим зеленим і пиронином;

5) придатні тільки певні види пиронина і свіжоприготовані його розчини в ацетоні;

6) обов’язково просвітлення в кедровому маслі перед укладанням в смолу.

ПРОТОТИПОМ пропонованого способу є метод Курника (1955) із застосуванням метилового зеленого — пиронина Y для виявлення ДНК та РНК (Е. Пірс, «Гистохимия», М. 1962, с. 74б).

МЕТОД ІЗ ЗАСТОСУВАННЯМ МЕТИЛОВОГО ЗЕЛЕНОГО — ПИРОНИНА Y ДЛЯ ВИЯВЛЕННЯ ДНК ТА РНК

6. Занурити в кедрове масло на 5 хв.

7. Укласти в пермаунт.

Хроматин забарвлюється в світло-зелений колір, ядерця — в яскраво-червоний, РНК цитоплазми — в яскраво-червоний, еозинофільні гранули і остеоід — також в яскраво-червоний.

Недоліки:

1) метод вимагає використання спеціальних фіксаторів;

2) для зневоднення і диференціювання підходить тільки н-бутанол;

3) обов’язково просвітлення в кедровому маслі;

4) придатний лише пиронин Y 05564 фірми «Gurr»;

5) необхідно екстрагувати СНС13 не тільки з метилового зеленого, але і з пиронина Y, що є досить трудомісткою процедурою;

МЕТА ВИНАХОДУ

Метою винаходу є забезпечення високої якості фарбування гістологічних препаратів, спрощення, скорочення тривалості та здешевлення процедури при збереженні стабільного виявлення в клітинах РНК і ДНК.

СУТНІСТЬ ВИНАХОДУ

Для фіксації матеріалу цілком підходить 10%-ний нейтральний формалін (або будь-який інший фіксатор).

1. Після депарафінізації зрізи доводять до води,

2. На зріз наносять 2-3 краплі 2%-ного водного розчину солі міцного синього ББ.

3. Через 5 хв зливають розчин і на зріз наносять по 2 краплі того ж розчину і суміші метилового зеленого і пиронина G (склад: 0,6 г метилового зеленого, 0,4 г пиронина G змішують в 20 мл гліцерину і доливають 80 мл дистильованої води. Реактиви розчиняють збовтуванням). Препарат фарбується протягом 5 хв.

4. Зливають фарбу і обполіскують в 2-х порціях дистильованої води.

5. Сушать насухо фільтрувальним папером і диференціюють ядра клітин у 2-х змінах 96 o етилового спирту.

6. Прояснюють у 2-х змінах ксилолу за 5 хв і укладають у канадський бальзам.

Результат фарбування. Хроматин ядер забарвлюється в різні відтінки зеленого кольору, РНК цитоплазми, еозинофільні гранули — в яскраво-червоний колір. Гранули тучних клітин — в різні відтінки червоного кольору (від світло-червоного до темного) залежно від ступеня грануляції і зрілості.

Реактив зберігає здатність до фарбування більше 3-х тижнів незалежно від способу зберігання. Препарати, забарвлені за цією методикою, добре витримують тривале зберігання.

ПОРІВНЯЛЬНИЙ АНАЛІЗ ОЗНАК ПРОТОТИПУ ТА ВИНАХОДИ

1. Пропонований спосіб на відміну від прототипу не вимагає застосування спеціальних фіксаторів.

2. Немає необхідності очищення пиронина хлороформом, що є обов’язковим в прототипі.

3. У пропонованому способі можна застосувати будь пиронин, незалежно від фірми (в методі Курника використовується пиронин Y 05564 фірми «Gurr»).

4. Цілком придатний для зневоднення і диференціювання ядер 96 o етиловий спирт.

5. Споліскування в дистильованій воді після фарбування не призводить до вимивання барвників незалежно від часу процедури.

6. Немає необхідності застосування спеціальних просвітлюючих речовин (в прототипі обов’язково занурення в кедрове масло).

7. Запропонований спосіб забезпечує стабільне фарбування клітинних структур, можливість корекції фарбування гістологічних препаратів із збільшенням або зниженням інтенсивності фарбування різних структур без шкоди для якості препарату, що виключено в прототипі.

8. Необов’язково використання для укладення спеціальних смол, цілком підходить канадський бальзам.

ПРИКЛАД КОНКРЕТНОГО ВИКОНАННЯ

Виписка з лабораторного журналу кафедри анатомії людини.

20.03.2000 р. Після декапітації під хлороформным наркозом брали препарати брижових лімфовузлів 3 білих щурів: інтактної щури ( 12), через 6 год після введення в черевну порожнину 2 мл фізіологічного розчину ( Ф6ч.22) і 2 мл перфторана ( F6ч.32) і фіксували в 10% нейтральному формаліні.

22.03.2000 р. Проведена проводка матеріалу за гістологічною батареї і заливки в парафін, потім пересадка на блоки.

23.03.2000 р. На мікротоми виготовлені серійні гістологічні зрізи, нанесені на предметні скла.

24.03.2000 р. Після депарафінізації в ксилолі препарати перенесені спершу в 96 o. потім у 70 o спирт, після чого споласкивали у 2 порціях дистильованої води. На зрізи нанесені по 2 краплі 2%-ного розчину солі міцного синього ББ. Через 5 хв розчин зливали і наносили по 2 краплі того ж розчину і по 2 краплі барвника (склад барвника: 0,6 г метилового зеленого і 0,4 г пиронина G змішували в 20 мл аптечного гліцерину і 80 мл дистильованої води). Зрізи фарбували протягом 5 хв, після чого ополаскивали у 2 порціях дистильованої води і сушили фільтрувальним папером. Для диференціації ядер використовували 2 зміни 96 o етилового спирту. Укладали препарати в канадський бальзам, попередньо просветляя за 5 хв в 2 бюксах з мета-ксилолом.

КОРИСНІСТЬ ПРОПОЗИЦІЇ

За цією методикою приготовлено понад 300 гістологічних препаратів лімфатичних вузлів, тонкої кишки та селезінки інтактних і піддослідних білих щурів на кафедрах анатомії людини та патологічної анатомії Дагестанської державної медичної академії з жовтня 1999 р.

Пропонованим способом вивчено клітинні реакції та зміни вмісту ДНК і РНК клітин брижових лімфатичних вузлів, тонкої кишки та селезінки при експериментальному каловом перитоніті, на тлі введення перфторана і в умовах норми.

Розроблений спосіб виключає використання і зменшує витрату ряду реактивів, забезпечує стабільне забарвлення клітин і клітинних структур, дозволяє коригувати інтенсивність фарбування різних структур без шкоди для якості гістологічних препаратів.

Література

1. Киселі Д. Практична микротехника і гистохимия. — Будапешт, 1962, с. 199.

2. Ліллі Р. Патогістологічна техніка і практична гистохимия. М. 1969, с. 146.

3. Меркулов Р. А. Курс патологогистологической техніки. Л. 1969, с. 275-279.

4. Пірс Е. Гистохимия. М. 1962, с. 744-746 (прототип).

Спосіб фарбування гістологічних препаратів, що полягає у фарбуванні гістологічних зрізів метиловим зеленим і пиронином, відрізняється тим, що додатково використовують 2%-ний водний розчин солі міцного синього ББ, яким попередньо обробляють препарат до нанесення суміші барвника, через 5 хв зливають розчин і на зріз наносять по 2 краплі 2%-ного водного розчину солі міцного синього ББ і суміші барвника наступного складу: 0,6 г метилового зеленого, 0,4 г пиронина, 20 мл гліцерину і 80 мл дистильованої води; для диференціювання ядер використовують 96 o етиловий спирт.

Короткий опис статті: препарати з гістології Винахід відноситься до медицини, а саме до гістології, може бути використано при морфологічних дослідженнях в патологічній анатомії, цитології, судової медицини норма витрати моторного масла, препарати при ацетоні

Джерело: Спосіб фарбування гістологічних препаратів

Також ви можете прочитати