Приготування кистологических препратов

16.08.2015

Реферат на тему Приготування кистологических препратов

Введення

Організм людини і тварин являє собою цілісну систему, в якій можна виділити ряд ієрархічних рівнів організації живої матерії: клітини — тканини — морфофункціональні одиниці органів — органи — системи органів. Кожен рівень структурної організації має морфофункціональні особливості, що відрізняють його від інших рівнів.

Гістологія (від грец. histos — тканина, logos — вчення) — наука про будову, розвиток і життєдіяльності тканин тваринних організмів.

Тканини являють собою систему клітин і неклеточных структур, об’єдналися і спеціалізувалися в процесі еволюції для виконання найважливіших функцій в організмі. Для кожної з основних тканинних систем характерні властиві саме їм про особливості будови, розвитку і життєдіяльності. Предметом загальної гістології. або власне вчення про тканини, є загальні закономірності, властиві тканинному рівнем організації та відмінні особливості конкретних тканин; предметом приватної гістології — закономірності життєдіяльності і взаємодії різних тканин в органах на більш високих рівнях організації. Приватна гістологія служить основою для мікроскопічного вивчення будови морфофункціональних одиниць органів і органів в цілому.

1.Виготовлення препаратів для світлової мікроскопії

Цитологічні (у т. ч. цитогенетичні) препарати поділяються на тимчасові і постійні.

1.1 Тимчасові препарати

Підготовка матеріалу для тимчасових препаратів включає фіксацію і забарвлення.

Фіксація

Фіксація – це процес швидкої консервації клітинних структур, при якому всі фізіолого-біохімічні процеси зупиняються, а водорозчинні речовини переходять в нерозчинне стан. Отже, фіксація дозволяє зберегти внутрішньоклітинні структури в незмінному вигляді тривалий час. Однак при фіксації в клітинах можуть з’являтися артефакти – нові структури, які відсутні в живій клітині, наприклад, різноманітні вакуолі. Для запобігання появи артефактів необхідно використовувати спеціально підібрані хімічні розчини – фіксатори, а сама фіксація повинна проводитися в певних умовах. Зокрема, бажано використовувати охолоджені фіксатори (до 2. 3 градусів); для фіксації потрібно брати окремі клітини чи шматочки тканин не товщі 5 мм; обсяг фіксатора повинен перевищувати обсяг зафіксованого матеріалу в 50. 100 разів; фіксатор не повинен використовуватися для тривалого зберігання матеріалу; фіксатор не повинен використовуватися повторно.

Розглянемо склад і застосування найбільш поширених фіксаторів.

Формалін

(формальдегід. або

мурашиний альдегід ). Найбільш простий і широко поширений фіксатор. Застосовується у вигляді водних розчинів з концентрацією 4. 10%, при цьому за 100% приймається концентрація продажного формаліну. Продажний формалін містить домішка мурашиної кислоти, яку нейтралізують за допомогою вуглекислого кальцію протягом 24 годин. Час фіксації від 1 години до 24 годин. Для тривалого зберігання матеріал переносять у свіжий 10%-ний формалін. Чистий формалін використовують у тому випадку, якщо планується подальше вивчення локалізації та активності ферментів. Частіше ж формалін включається в рецептуру більш складних фіксаторів.

Спиртові фіксатори. Містять етиловий або метиловий спирт. Водні розчини спиртів в чистому вигляді (70%, 96% або 100%) використовуються відносно рідко. Частіше застосовують 100%-ві спирти. які змішують з іншими речовинами. Потрібно мати на увазі, що метиловий спирт (метанол) та його пари – отруйні!

В якості універсальних фіксаторів використовують різні композиції на основі формаліну, спиртів, органічних кислот і неорганічних речовин.

(ацеталкоголь ). Це один з найбільш простих фіксаторів. Складається з 3 частин абсолютного спирту (етилового, а краще –

метилового) і 1 частини крижаної оцтової кислоти. Для приготування 100%-ного (абсолютного) спирту вихідні спирти зневоднюють. Для зневоднення етилового спирту (етанолу) використовують безводний сульфат міді, а для зневоднення метилового спирту (метанолу) – використовують оксид кальцію. Зберігають їх в герметичній посуді. Потрібно мати на увазі, що всі абсолютні спирти особливо отруйні! Для приготування крижаної оцтової кислоти вихідну концентровану кислоту охолоджують в холодильнику; при цьому кислота замерзає, раніше, ніж вода. Рідину зливають, а замерзлу кислоту відтають і використовують для приготування фіксатора. Фіксатор готовий для вживання через 24 години. Зберігати фіксатор в темному холодному місці. Час фіксації – 2. 24 години. Потім матеріал переносять у свіжий фіксатор, в якому він може зберігатися до 1 місяця в холодильнику. Для більш тривалого зберігання матеріал переносять у 70%-ний спирт.

Фіксатор Карнуа. Склад – 1 частина крижаної оцтової кислоти. 6 частин абсолютного спирту. 3 частини хлороформу. Це універсальний фіксатор, який забезпечує швидку фіксацію (протягом 1. 2 годин).

Фіксатори, що містять пікринову кислоту. наприклад, суміш Буена – 15 мл насиченого водного розчину пікринової кислоти. 5 частин формаліну. 1 частина крижаної оцтової кислоти. Цей фіксатор готують безпосередньо перед вживанням. Час фіксації від 1 до 24 годин (іноді кілька діб). Фіксований матеріал зберігають у 70%-ном спирті.

Фіксатори, що містять сулему (хлорид ртуті ( II ) – HgCl 2 ). Сулема використовується у вигляді насиченого водного розчину в суміші з крижаною оцтовою кислотою (25. 1), формаліном (8,5. 1) і більш складних композицій (фіксатор «Суза», фіксатор Ценкера та ін). Час фіксації від 1 до 24 годин. Потім сулему видаляють спиртовим розчином йоду (6 частин 70%-ного спирту. 1 частина йодної настойки), а йод видаляють 70%-ним спиртом. Фіксований матеріал зберігають у 70%-ном спирті. Обережна, сулема отруйна!

Фіксатори, що містять осмій (четырехокись осмію, або осмиевая кислота). Дають найкращі результати, які використовуються при виготовленні препаратів для світлової, так і електронної мікроскопії. Можна використовувати 1. 2%-ний розчин осмієвої кислоти, але частіше застосовують композиції, наприклад, фіксатор Флеммінга – 15 частин 2%-ної осмієвої кислоти. 1 частина крижаної оцтової кислоти. Фіксація протікає повільно (від 24 годин до кількох діб). Обережно, осмиевая кислота і її пари отруйні!

Крім перерахованих фіксаторів загального призначення, існують і спеціальні фіксатори. Наприклад, фіксатор для мітохондрій містить 4 частини 3%-ного р-ра дихромата калію і 1 частина 40%-ного формаліну. Фіксатор для хлоропластів містить 15 частин насиченого р-ра мідного купоросу, 1 частина 40%-ного формаліну і 5 частин води.

У ряді випадків замість хімічної фіксації застосовується швидке заморожування зразків, наприклад, при температурі рідкого азоту (-196 0 ) або при температурі сухого льоду (0 -78 ). Заморожені об’єкти можуть бути зневоднені шляхом сублімації води у вакуумі при температурі нижче -40 0 (цей процес називається ліофілізація).

Фарбування

Фарбування дозволяє виявляти внутрішньоклітинні структури, що володіють підвищеним спорідненістю до певних барвників. Барвники – це відносно низькомолекулярні органічні речовини, що володіють підвищеним спорідненістю до певних хімічних компонентів клітини.

Існує безліч барвників, які використовуються для різних цілей. Потрібно мати на увазі, що вибір барвника пов’язаний з характером фіксації і різними методами попередньої обробки клітин.

Назви барвників можуть відповідати одержуваної забарвленням (рубін, кармін, метиловий синій, метиленовий синій, генциановый фіолетовий, метиловий зелений, помаранчевий золотий ). Іноді російські назви кольорів замінюють на німецькі, наприклад: метилблау, генціанвіолет. В інших випадках назви носять абстрактний, історично сформований характер, наприклад: пиронин, фуксин, сафранін, флороглюцин, судан III. Іноді назва барвника не відповідає отриманої забарвленням, наприклад, синій тионин дає фіолетово-червоне фарбування. Досить рідко застосовуються хімічні номенклатурні назви барвників, наприклад: диметилбензальдегіду, 8-аміно-1-нафтол-5-сульфокислота .

Розрізняють основні (лужні), кислотні і нейтральні барвники. Основні барвники вибірково фарбують базофільні клітинні структури (тобто структури з кислотними властивостями). Кислотні барвники вибірково фарбують ацидофільні або оксифильные клітинні структури (тобто структури з лужними властивостями). Нейтральні барвники фарбують і базофільні, і ацидофільні структури.

Найменш токсичні барвники використовуються для прижиттєвого фарбування клітин. Ці барвники зазвичай застосовують у вигляді водних розчинів, наприклад: метиленовий синій (концентрація 1. 1000 до 1. 10000), трипановый синій (0,5%-ний р-н), нейтральний червоний (від 1. 50000 до 1. 200000).

Барвники для фіксованих клітин можуть використовуватися в чистому вигляді (водні або спиртові розчини, концентрація від 0,1% до 1%), наприклад: еозин, фуксин. Часто використовують суміші барвників, наприклад, суміш Романовського–Гімза (містить метилен–азур , метиленовий фіолетовий , метиленовий синій еозин ), забарвлення за Маллорі (послідовне використання кислотного фуксину S. а потім суміші

анілінового синього і помаранчевого золотого G ), азур–еозин , метилблау–еозин .

Однак частіше барвник утворюється в ході його приготування. Наприклад, широко відоме речовина рослинного походження гематоксилін стає барвником тільки після його окислення до гематеина. Для фарбування ядер і хромосом широко використовуються барвники в поєднанні з органічними кислотами. Розглянемо методики приготування деяких найбільш простих барвників.

Приготування 2%-ного ацетофуксина. 1 г основного фуксину розчиняють у 50 мл 40%-ної оцтової кислоти при підігріванні на водяній бані.

Приготування 1%-ного ацеторсеина. До 1 граму орсеина додають 50 мл крижаної оцтової кислоти і настоюють близько 12 годин. Потім суміш нагрівають до кипіння і додають 50 мл дистильованої води. Потім нагрівають до кипіння і охолоджують, повторюючи цю процедуру 10 разів. Через добу барвник фільтрують. Перед фарбуванням на 9 частин барвника додають 1 частину 1 н HCl .

Приготування 4%-ного ацетокармина. Розчин готують в термостійкої колбі з водяним холодильником. 4 грама ацетокармина змішують з 100 мл 50%-ної оцтової кислоти і кип’ятять 1 годину. Через добу барвник фільтрують. Аналогічним чином готується ацетолакмоид.

Замість оцтової кислоти часто використовують інші органічні кислоти, наприклад, 40%-ву молочну кислоту.

Усі барвники після приготування фільтрують і зберігають у темному прохолодному місці. Час фарбування препаратів залежить від температури (зазвичай від 20 хвилин до 1 доби). При нагріванні або кип’ятінні час фарбування скорочується.

Крім фарбування органічними барвниками окремі структури можна виділити, використовуючи їх импрегнацию сріблом та іншими металами.

1.2 Постійні препарати

Постійні препарати готуються за спеціальними методиками, які забезпечують їх зберігання протягом десятків років. До постійних препаратів належать мазки, тотальні препарати і зрізи. Мазки використовуються при вивченні клітин крові, культур мікроорганізмів, ізольованих тканинних клітин. Тотальні препарати представляють собою окремі прозорі і тонкі об’єкти (від англ total – цілком, повністю). Однак у більшості випадків для виготовлення препаратів використовуються досить товсті зразки тканин, які служать для виготовлення зрізів.

Навчальні зрізи можна зробити вручну, за допомогою бритви. Проте якісні зрізи з заданою товщиною 10. 22 мікрометра зазвичай виготовляють з допомогою спеціальних приладів – мікротомів. Такі

зрізи часто називають микротомными препаратами. Для отримання більш тонких зрізів (0,01. 0,05 мкм, або 10. 50 нанометрів) використовують ультрамикротомы.

Коротко розглянемо основні етапи приготування микротомных препаратів.

1.Взяття матеріалу (шматочка тканини або органу) для приготування препарату. При цьому враховують наступні моменти:

— забір матеріалу повинен проводитися якомога раніше після смерті або забою тваринного, а при можливості живого об’єкта (біопсія), щоб краще збереглися структури клітини, тканини чи органу;

— паркан шматочків повинен проводитися гострим інструментом, щоб не травмувати тканини;

— товщина шматочків не повинна перевищувати 5 мм, щоб фіксуючий розчин міг проникнути в товщу шматочка;

— обов’язково проводиться маркування шматочка (зазначається найменування органу, номер тваринного або прізвище людини, дата забору і так далі.

2.Фіксація матеріалу

Відразу після закінчення фіксації виробляється промивка матеріалу або водою (після водних фіксаторів), або 80%-ним спиртом (після спиртових фіксаторів). Кількість змін промивних рідин – не менше 3. Час – до 24 годин. Фіксація забезпечує запобігання процесів розкладання, що сприяє збереженню цілісності структур. Це досягається тим, що взятий з органу маленький зразок або занурюють у фіксатор (спирт, формалін, розчини солей важких металів, осмиевая кислота, спеціальні фіксуючі суміші), або піддають термічній обробці. Під дією вивільнення у тканинах і органах відбуваються складні фізико-хімічні зміни. Найбільш суттєвим з них є процес необоротній коагуляції білків, внаслідок якої життєдіяльність припиняється, а структури стають мертвими, фіксованими. Фіксація приводить до ущільнення та зменшення обсягу шматочків, а також до покращення подальшої забарвлення клітин і тканин.

3. Зневоднення в спиртах зростаючої концентрації. Паралельно відбувається ущільнення матеріалу. Послідовне переміщення матеріалу через ряд розчинів називається проводка. Після водних фіксаторів використовується 8 змін спирту: 20%, 40%, 80%, дві зміни по 96%, дві зміни по 100%. Після спиртових фіксаторів – 4 зміни спирту. дві зміни по 96% та дві зміни по 100%. У кожній зміні матеріал витримується по 1 годині.

4. Просвітлення

Це просочування матеріалу розчинником парафіну – ксилолом (бензолом, хлороформом). Зразок поміщається на 1 годину послідовно в кожен з наступних розчинів: 3 частини спирту + 1 частину ксилолу, потім 2 частини спирту + 2 частини ксилолу, потім 1 частина спирту + 3 частини ксилолу, потім дві зміни ксилолу.

5. Заливання в парафін

Це заміщення ксилолу парафіном. Зразок поміщають в суміш ксилолу і парафіну при температурі 55. 57 градусів і залишають в термостаті при цій температурі до повного випаровування ксилолу (від кількох годин до кількох діб). Потім при температурі 55. 57 градусів здійснюється проводка через парафін I (6. 12 годин), парафін II (6. 12 годин) і заливки в парафін III. Парафіни I , II , III відрізняються тільки чистотою: парафін III – це остаточна середовище, яка повинна володіти найбільшою чистотою. У підсумку виходять парафінові блоки, в яких укладені зразки матеріалу. Ці блоки можна різати в будь-якому напрямку.

6. Приготування зрізів на спеціальних приладах (мікротоми або ультрамикротоме) з допомогою спеціальних ножів. Зрізи для світлової мікроскопії приклеюються на предметні скла, а для електронної мікроскопії – монтується на спеціальні сіточки.

7. Фарбування

зрізів. Парафінові зрізи наклеюють на чисте предметне скло. В якості клею можна використовувати суміш білка курячого яйця з гліцерином (у співвідношенні 1. 2) з додаванням антисептика (тимолу або фенолу). Зазвичай виробляють депарафинирование зрізів. Для цього скла з наклеєними зрізами проводять через ксилол, спирти зменшенням концентрації(100%, 96%, 80%, 70%) і дистильовану воду. Час знаходження в кожній середовищі – 2. 3 хвилини. Далі фарбують згідно з методиками. Фарбування зрізів (у світлової мікроскопії) або напилення їх солями металів (в електронній мікроскопії) застосовують для збільшення контрастності зображення окремих структур при розгляданні їх у мікроскопі. Методи фарбування гістологічних структур дуже різноманітні і обираються залежно від завдань дослідження.

Гістологічні барвники (по хімічній природі) підрозділяють на кислі, основні та нейтральні. В якості прикладу можна навести найбільш уживаний барвник гематоксилін. який фарбує ядра клітин у фіолетовий колір, і кислий барвник — еозин. забарвлює цитоплазму в рожево-жовтий колір. Виборче спорідненість структур до певних барвників зумовлена їх хімічним складом і фізичними властивостями. Структури, добре окрашивающиеся кислими барвниками, називаються оксифильными, а окрашивающиеся основними —базофильными. Наприклад, цитоплазма клітин найчастіше забарвлюється оксифильно, а ядра клітин – забарвлюються базофильно.

Структури, що сприймають як кислі, так і основні барвники, є нейтрофильными (гетерофильными). Забарвлені препарати зазвичай обезводнюють у спиртах зростаючої міцності і прояснюють у ксилолі, бензолі, толуолі або деяких оліях. Для тривалого збереження зневоднений гістологічний зріз укладають між предметним та покривним склом у канадський бальзам або інші речовини. Готовий гістологічний препарат може бути використаний для вивчення під мікроскопом протягом багатьох років.

Для електронної мікроскопії зрізи, отримані на ультрамикротоме, поміщають на спеціальні сітки, контрастують солями урану, свинцю та інших металів, після чого переглядають у мікроскопі і фотографують. Отримані мікрофотографії служать об’єктом вивчення поряд з гістологічними препаратами.

8. Зневоднення і просвітлення забарвлених зрізів. Виконується шляхом проведення через спирти зростаючої концентрації, а потім через ксилол.

9. Висновок середовища

(заливка). Для тривалого зберігання препаратів їх слід укласти в середу, захищає препарат від окислення повітрям і від ураження грибками. Для заливки використовуються спеціальні смоли (канадський бальзам, ялицевий бальзам), які розчиняють у ксилолі до консистенції рідкого меду. Краплю такого розчину наносять на зріз і покривають покривним склом.

Для прискореного приготування препаратів зневоднення забарвлених зрізів не виробляють, а для заливки використовують гліцерин–желатину. Для приготування цього середовища 15 г чистого (білого) желатину розчиняють у 100 мл дистильованої води при нагріванні, додають 100 г гліцерину і 2 краплі фенолу.

У ряді випадків для приготування зрізів використовуються заморожують микротомы. Замораживающей рідиною служить рідка вуглекислота. На замораживающем мікротоми можна різати фіксований і нефіксований матеріал. Гідність заморожувальних мікротомів в тому, що не потрібно тривалої проводки зразків через різні середовища.

2.Приготування препаратів для електронної мікроскопії

Для цілей електронної мікроскопії в етапах приготування препаратів є деякі особливості, але загальні принципи ті самі. Головна відмінність полягає в тому, що гістологічний препарат для світлової мікроскопії може тривало зберігатися і багаторазово використовуватися. Зрізи для електронної мікроскопії використовуються одноразово. При цьому спочатку цікавлять об’єкти препарату фотографуються, а вивчення структур проводиться вже на электроннограммах.

З тканин рідкої консистенції (кров, кістковий мозок та інші) виготовляються препарати у вигляді мазка на предметному склі, які також фіксуються, фарбуються, а потім вивчаються.

З ламкого паренхіматозних органів (печінка, нирки та інші) виготовляються препарати у вигляді відбитка органу: після розлому або розриву органу, до місця розлому органу прикладається предметне скло, на яке приклеюються деякі вільні клітини. Потім препарат фіксується, забарвлюється і вивчається.

І нарешті, з деяких органів (брижа, м’яка мозкова оболонка) або з пухкої волокнистої сполучної тканини виготовляються плівкові препарати шляхом розтягування або роздавлювання між двома стеклами, з наступною фіксацією, забарвленням, заливкою в смоли і подальшому вивченні.

3.Виготовлення препаратів для трансмісійної мікроскопії

Для фіксації матеріалу зазвичай використовують осмиевую кислоту. Для заливки зневодненого препарату використовують різні смоли (а не парафін). Для виготовлення надтонких зрізів (товщиною 20. 100 нм) використовується ультрамикротом з алмазними або скляними ножами. Замість фарбування органічними барвниками використовується імпрегнація зразка солями свинцю, урану, осмію. Часто замість імпрегнації виробляють напилення поверхні зразка важкими металами.

Для вивчення мембран використовуються більш складні методики приготування препаратів. Наприклад, спочатку зразок тканини заморожується при температурі менше 100 О. Потім зразок розколюється гострим ножем. При цьому часто тріщина проходить паралельно площині мембрани. В результаті оголюються раніше приховані структури, наприклад, інтегральні білки.

Потім створюється репліка відколу. Спочатку у вакуумі здійснюється сублімація льоду. На поверхню відколу наноситься шар вуглецю, а на цю репліку з вуглецю напилюється важкий метал. Біологічні структури розчиняються в сильній кислоті. Отримана поверхня є точною копій біологічною структурою.

Електрони, що пройшли через зразок, фокусуються і спрямовуються на флуоресцентний екран, на якому і формується видиме зображення.

Зміст

Вступ

1.Виготовлення препарату для світлової мікроскопії

1.1 Тимчасові препарати

1.2 Постійні препарати

2.Приготування препаратів для електронної мікроскопії

3.Виготовлення препаратів для трансмісійної мікроскопії

Короткий опис статті: препарати з гістології Тема: Приготування кистологических препратов. Тип: Реферат. Мова: російська. Розмістив (ла): Павел Воля. Розмір: 31 кб. Категорія: Біологія. Короткий опис: ‘Організм людини і тварин являє собою цілісну систему, в якій можна виділити ряд ієрархічних рівнів організації живої матерії: клітини — тканини — морфофункціональні одиниці органів — органи — системи органів’ Реферат Приготування кистологических препратов Біологія

Джерело: Приготування кистологических препратов

Також ви можете прочитати