Гістологія, зразки, барвники і артефакти

19.07.2015

Гістологія — зразки, барвники і артефакти

Гістологія, зразки, барвники і артефакти

Гістологія, зразки, барвники і артефакти
Гістологія (термін утворений з’єднанням грецьких слів «histos»-«тканина» і «-logia»-«наука») — це дослідження анатомії клітин і тканин представників рослинного і тваринного світу в мікроскопічному масштабі. Як правило, воно проводиться за допомогою аналізу тканин і клітин за допомогою зрізу і фарбування з наступним вивченням під світловим або електронним мікроскопом. Можна проводити гістологічні дослідження з допомогою тканинної культури, де можна виділити живі клітини і підтримувати їх в належній середовищі за межами організму в різних науково-дослідних роботах. Здатність візуалізувати або диференціально визначати мікроскопічні структури часто підвищується за рахунок використання гістологічних барвників. Наука гістології служить важливим інструментом для біології та медицини.

Продовження нижче ⇓

. рівнях його структурної організації при різних порушеннях функцій, патологічних процесах і хворобах. Історія розвитку анатомії, гістології і патологічної анатомії, що вивчає узагальнені морфологічні стереотипи, свідчить про можливості детального опису.

Велике значення для анатомічної патології має гистопатология. представляє собою вивчення ураженої тканини під мікроскопом. Гистопатологическая експертиза зразків необхідна для точної діагностики онкологічних та інших захворювань. Гістопатологічні дослідження проводяться кваліфіковані лікарі, найчастіше це сертифіковані патологоанатоми, які займаються підготовкою діагностичної інформації на основі своїх спостережень.

Підготовкою гістологічних зрізів займаються кваліфіковані вчені, серед яких гистотехники, вчені-медики, техніки і технологи гістології, биомедики або медичні лаборанти. Область їх досліджень називається гистотехнологией .

Зміст

Підготовка зразка

Підготовка гістологічного зразка складається з декількох етапів.

Фіксація

Для запобігання руйнування тканини і збереження структури клітин і субклітинних компонентів, таких як клітинні органели (наприклад, ендоплазматичний ретикулум, ядро, мітохондрії) використовуються хімічні фіксатори. Найбільш поширений фіксатор для світлової мікроскопії — це 10% нейтральний буферний формалін (4% формальдегід у фосфатному буферному розчині солі). В електронній мікроскопії найчастіше використовується такий фіксатор, як глутаральдегид, як правило, у формі 2,5% розчину у фосфатному буферному фізіологічному розчині. Ці фіксатори зберігають тканини або клітини, в основному, за допомогою білків, що утворюють незворотні поперечні зв’язки. Основним дією цих альдегідних фіксаторів є зшивання аміногруп в білки шляхом утворення метиленовых містків (-СН2-) у разі формальдегіду, або з допомогою зшивок C5H10 у разі глутаральдегід. У цьому процесі, зберігає структурну цілісність клітин і тканин, може пошкодитися біологічна функція білків, зокрема ферментів, а також можуть змінитися їх природні властивості певної міри. Це може бути шкідливо для деяких гістологічних методів. Інші фіксатори, часто використовувані в електронній мікроскопії, це тетроксид осмію або уранилацетат.

Фіксація формаліном веде до деградації мРНК, мірнк і ДНК в тканині. Тим не менш, аналіз. екстракція і ампліфікація цих нуклеїнових кислот із зафіксованих у формаліні, залитих у парафін тканин можливі з допомогою відповідних протоколів.

Заморозка — це швидкий спосіб зафіксувати і встановити гістологічні зрізи. При використанні в хірургічному видаленні пухлини з допомогою цього методу можна швидко визначити межі (підтверджуючи повне видалення пухлини). Для цього використовується охолоджуючий пристрій, зване криостатом. З допомогою микротома розрізають заморожені тканини і поміщають заморожені зрізи на предметне скло, і забарвлюють так само, як в інших методах. Крім того, незафіксовані заморожені зрізи можна використовувати в дослідженнях, в яких потрібна локалізація ферменту в тканинах і клітинах. Це необхідно для фіксації тканини для певного барвника, наприклад, в иммунофлуоресцентном фарбуванні, пов’язаному з антитілом. Його також можна використовувати для визначення злоякісності пухлини при її випадковому виявленні під час операції на пацієнта.

Обробка — дегідратація, очищення та інфільтрація

Мета обробки тканини полягає у видаленні води з тканин і заміщення середовищем, яка твердне, щоб нарізати тонкі зрізи. Біологічну тканину слід підтримувати на жорсткому матриксі, щоб дозволити нарізку досить тонких зрізів, як правило, товщиною 5 мкм в світлової мікроскопії і товщиною 80-100 нм в електронній мікроскопії. Найчастіше в світлової мікроскопії використовується парафін. Враховуючи його нездатність змішуватися з водою, а це основний компонент біологічної тканини, воду необхідно спочатку видалити в процесі дегідратації. Для видалення води зразки переміщуються через ванни з етанолом з поступово наростаючою концентрацією. Після цього слід обробка гідрофобним координаційною агентом (наприклад, ксилолом, щоб видалити спирт, і, нарешті, розплавленим парафіном, агентом інфільтрації, замінюючим ксилол. За допомогою парафіну не можна домогтися досить жорсткого матриксу для нарізки найтонших зрізів в електронній мікроскопії. Тому замість нього використовуються смоли. Найчастіше застосовуються епоксидні смоли у якості середовища для заливки, але також використовуються і акрилові смоли, зокрема, коли потрібно імуногістохімія. Для світлової мікроскопії також можуть бути нарізані більш товсті зрізи (0,35-5 мкм) тканини, залитої в смолу. Знову-таки, нездатність змішуватися з водою, якою відрізняється більшість епоксидних і акрилових смол, що призводить до необхідності дегідратації, як правило, з використанням етанолу.

Після дегідратації, очищення і просочення тканин матеріалом для заливки вони готові для зовнішньої заливки. У цьому процесі зразки тканин поміщаються у форми з рідким матеріалом (наприклад, агаром, желатином або воском). Матеріал потім твердне за рахунок охолодження при використанні парафіну та нагріву (витяг) при використанні епоксидних смол. Для полімеризації акрилових смол застосовують тепло, ультрафіолетове світло або хімічні каталізатори. Отверділі блоки, що містять зразки тканин, потім готові до нарізки зрізів.

Так як зафіксовані формаліном, залиті в парафін тканини можуть зберігатися при кімнатній температурі нескінченно, а нуклеїнові кислоти (ДНК і РНК) можна відновити з них через багато років після фіксації, такі тканини (FFPE) є важливим джерелом для історичних досліджень в медицині.

Заливка також може бути виконана з використанням замороженої, незафіксованою тканини в середовищі на основі води. Тканини після попередньої заморозки поміщаються у форми з рідким матеріалом заливки, як правило, гліколем на водній основі, TBS, OCT, криогелем або смолою, які заморожуються для формування отверділих блоків.

Зріз можна отримати за допомогою обмежених способів. Звичайним методом є вертикальний зріз перпендикулярно до поверхні тканини. Найчастіше у оцінці волосяних фолікулів і сально-волосяних одиниць робиться горизонтальний зріз. За напрямом по дотичній до горизонтального зрізу виконується в методах CCPDMA і в хірургії Мооса.

У світлової мікроскопії для нарізки зрізів тканини товщиною 4 мкм, які розташовані на предметному склі мікроскопа, використовується сталевий ніж, встановлений в мікротоми. У просвічує електронної мікроскопії для нарізки зрізів тканини товщиною 50 нм, які розташовані на мідною сіткою діаметром 3 мм, використовується алмазний ніж, встановлений в ультрамикротоме. Встановлені зрізи потім обробляють відповідним барвником.

Залиту в заморожуюче середу заморожену тканину нарізають на мікротоми в охолодженій машині (кріостат). Для забезпечення товщини 1-10 мкм слід використовувати тільки мікротом.

Фарбування

Біологічна тканина відрізняється невеликим властивим контрастом під світлом або електронним мікроскопом. Щоб надати тканині контраст, а також виділити представляють інтерес особливості, застосовується фарбування. Термін «гистохимия» використовується там, де розуміється основна механістична хімія фарбування. В гістології та гистопатології найчастіше використовується фарбування гематоксилином та еозином в якості світлового мікроскопічного барвника. Під дією гематоксиліну, основного барвника, ядра забарвлюються в синій колір із-за близькості до нуклеїнових кислот у клітинному ядрі; еозин, кислотний барвник забарвлює цитоплазму в рожевий колір. Щоб надати тканині контраст в електронній мікроскопії, зазвичай використовують уранилацетат і цитрат свинцю.

Крім того, розроблені численні методи з метою виборчого фарбування клітин і їх компонентів. Одним з основних прикладів практичного використання є маркування периферійних пухлин або хірургічного краю. У цьому методі різні кольору барвника застосовуються до різних кордонів зразка, допомагаючи виявити місце розташування пухлини або який-небудь іншої патології в ньому. Інші сполуки, що використовуються для фарбування зрізів тканин, включають сафранін, масляний Про червоний, конго червоний, солі срібла, міцний зелений FCF і безліч натуральних і штучних барвників, що відбуваються, як правило, від барвників, що використовуються для обробки у текстильній промисловості.

Гистохимия — це наука, яка використовує хімічні реакції між хімічними лабораторними речовинами і компонентами в тканини. Зазвичай виконується така гистохимическая техніка, як забарвлення за Перлсом, допомагає продемонструвати відкладення заліза в разі таких захворювань, як гемохроматоз.

Часто зразки гістології досліджуються за допомогою радіоактивних методів. У гисторентгенографии рентгеном обробляється слайд (іноді гістохімічно пофарбований). Авторадиография використовується найчастіше для візуалізації місця, до якого було переміщено радіоактивна речовина в організмі, наприклад, клітини в S-фазі (проходять реплікацію ДНК), що з’єднуються з меченным тритієм тимидином, або ділянки, до яких прив’язуються зонди радіоактивних нуклеїнових кислот у місці гібридизації. Зазвичай в авторадиографии на мікроскопічному рівні слайд занурюють в рідку емульсію ядерного тракту, яка висихає, утворюючи плівку експозиції. Окремі серцевинні промені у плівці візуалізують з допомогою темнопольної мікроскопії.

Нещодавно для конкретної візуалізації білків, вуглеводів і жирів були використані антитіла. Цей процес називається імуногістохімія, або при фарбуванні флуоресцентної молекулою — імунофлюоресценція. Цей метод значно підвищує можливість визначити під мікроскопом категорії клітин. Можна об’єднати інші додаткові техніки, такі як нерадиоактивная локалізована гібридизація, з иммунохимией з метою визначення конкретних молекул ДНК або РНК за допомогою флуоресцентних зондів або міток, що потенційно використовуються для иммунофлуоресцентной і фермент-пов’язаної флуоресцентної ампліфікації (особливо лужна фосфатаза і тирамидная сигнальна ампліфікація). Люмінесцентна мікроскопія і конфокальна мікроскопія використовуються для виявлення флуоресцентних сигналів з хорошою внутрішньоклітинної деталізацією. Все частіше використовуються цифрові фотоапарати для захоплення гістологічних та гістопатологічних зображень.

Відео про гістології
Поширені лабораторні барвники

Короткий опис статті: гістологію Західна медицина — понад 1000 статей про засоби і методи західної медицини з профілактики та лікуванню захворювань. медицина, західна

Джерело: Гістологія — зразки, барвники і артефакти

Також ви можете прочитати