Гістологічна техніка

28.07.2015

Гістологічна техніка

Гістологічна техніка

Робочий стіл.

При відсутності спеціального столу з успіхом може бути пристосований будь стіл (бажано з ящиками) з площею робочої поверхні не менше 60*120 див.

Якщо кришка стола не має спеціального покриття, то його слід зробити з будь-якого вологостійкого матеріалу. Однак ділянку столу, призначений для безпосередньої роботи з приготування препаратів, в будь-якому випадку необхідно накрити склом і розташувати під ним невеликі (9*12см) аркуші білого або чорного паперу. Цим створюється відповідний фон, що полегшує роботу з пофарбованими (білий аркуш) і не пофарбованими (чорний лист) об’єктами. Рекомендується також на обидва листи нанести контури предметного скла з позначенням місця розташування і розмірів покривного скла. Це простий прийом дозволяє раціонально розмістити на предметному склі зрізи в процесі укладання.

Для того, щоб зручніше розташувати необхідне обладнання, слід мати двоярусну полицю для реактивів, розчинів і посуду, яка встановлюється або перед працюючим (вздовж заднього краю столу), або збоку в залежності від розташування столу щодо джерела світла.

ЛАБОРАТОРНИЙ ПОСУД

У цьому розділі дається опис лише найнеобхідніших зразків.

ШИРОКОГОРЛИЄ БАНКИ З ПРИТЕРТИМИ ПРОБКАМИ різної місткості від 50 до 200 мл– використовують для складання гістологічних батарей, призначених для підготовки шматочків тканин до заливання різними середовищами. Більш великі банки застосовують для фіксації і зберігання шматочків тканин у фіксуючих рідинах, обробки предметних стекол, приготування нейтрального формаліну та ін

Замість банок з притертими пробками можна використовувати невеликі господарські банки з бляшаними кришками, що загвинчуються різного обсягу.

БЮКСИ—невеликі круглі скляні стаканчики різного діаметру і висоти з шліфованими кришками

БІОЛОГІЧНІ СТАКАНЧИКИ—круглі. овальні або чотирикутні ( як і високі бюкси) застосовують для проведення гістологічних зрізів, монтувати на предметних стеклах. Для додання стійкості і забезпечення порядку в розміщенні їх поміщають в спеціальні стійки, виготовлені з дерева або пластмаси, по кілька штук в ряд залежно від методики обробки.

ЧАШКИ ПЕТРІ—широкі, плоскі скляні чашки з кришками– придатні для різних маніпуляцій ( забарвлення вільно плаваючих і наклеєних на предметні скла зрізів, використання в якості підставок під бюкси і т. д.).

МІРНИЙ ПОСУД– циліндри і мензурки різної місткості (від 10 до 250-500 мл) воронки різних розмірів.

ХІМІЧНІ СТАКАНЧИКИ—круглі скляні стаканчики без кришок місткістю 50-100 мл– знаходять широке застосування при проведенні гістохімічних реакцій, забарвлення зрізів наклеєних на скло і т. д.

КОЛБИ (плоскодонні) місткістю від 50 мл до 2 л Малі колби застосовують для приготування і зберігання розчинів різних барвників, великі—під дистильовану воду та інші рідини, які витрачаються у великих кількостях.

ПІПЕТКИ звичайні (призначені для закапування ліків) використовують для накапывания на зрізи барвників і різних рідин, градуйовані (місткістю 0,1-100 мл) застосовують для відмірювання малих кількостей різних рідин. Можна використовувати в даний час широко використовуються автоматичні піпетки різної місткості.

ПРЕДМЕТНІ СКЛА — прямокутні пластини розміром 76*25 мм товщиною 1 мм призначені для розміщення гістологічних зрізів в процесі приготування постійних препаратів.

ПОКРИВНІ СКЛА являють собою тонкі (0,15-0,2 мм товщини) пластинки різних розмірів. Служать для покриття оброблених зрізів, розташованих на предметних стеклах. Розміри покривних скелець вибирають залежно від площі об’єкта.

ІНСТРУМЕНТИ

Інструменти, використовувані в гістологічної лабораторії, включає пінцети, скальпелі, кровоспинні затискачі, корнцанг, шпателі, препаровальные голки– прямі і вигнуті, металеві та скляні. Скляні голки необхідні при імпрегнації сріблом, коли металеві голками користуватися не можна,

Так само необхідно мати спиртівку, волосяну пензлик для зняття зрізів з микротомного ножа, фільтрувальний папір, голки, нитки, картон для етикетування матеріалу, лейкопластир і олівець по склу.

ТЕХНІКА ПРИГОТУВАННЯ ГІСТОЛОГІЧНИХ ПРЕПАРАТІВ

Взяття матеріалу, його фіксація і ущільнення.

Умертвіння експериментальних тварин

В лабораторній практиці застосовують ряд методів умертвіння експериментальних тварин: відсікання голови (декапітація), умертвіння за допомогою наркозу, пропускання електричного струму через тіло тварини, введення в кровоносне русло повітря (укол в серце або внутрішньовенно) або в плевральну порожнину ефіру(хлороформу)

Вибір методу диктується видом тварини і цілями дослідженнями, але найбільше поширення в лабораторній практиці одержали два перших способи умертвіння.

Відсікання голови (декапітація) є основним способом умертвіння дрібних лабораторних тварин (жаби, миші, щури) і здійснюється з допомогою ножиць.

Взяття матеріалу.

Матеріалом для гістологічного дослідження можуть служити шматочки органів експериментальних тварин. Отриманий шляхом прижиттєвого висічення у людини шматочків тканин( біопсія), трупний матеріал, мазки рідких досліджуваних матеріалів (крові, кісткового мозку).

Після вбивства тіло тварини швидко фіксують у положенні на спині. Жаб, тритонів, мишей та інших дрібних лабораторних тварин фіксують на дощечках, воскових або пробкових платівках, прикалывая за розтягнуті в сторони лапки. Для фіксації середніх і великих лабораторних тварин використовують спеціальні верстати або ж виготовлені для цих цілей дошки (оцинковані або пофарбовані з убитими по краях гачками або гвоздиками для прив’язування кінцівок)

Техніка розтину черевної і грудної порожнин для всіх лабораторних тварин однакова. Проте у тварин мають волосяний покрив, спочатку слід висікти досить широкий шкірний клапоть, щоб уникнути забруднення внутрішніх органів. Для цього, захопивши і піднявши ( з допомогою хірургічного пінцета) шкіру нижньої частини стінки живота по середній лінії, підрізають ножицями утворилася складку по напрямку до голови, зрізуючи шкірний клапоть на потрібному протязі.

Потім слід змінити ножиці (або очистити їх від прилиплої вовни) і видалити вологим тампоном шерсть, потрапила на утворену «доріжку».

РОЗТИН ЧЕРЕВНОЇ ПОРОЖНИНИ.

Нижню частину стінки живота піднімають пінцетом по середній лінії ( що б не пошкодити органи), прорізають ножицями вхід в черевну порожнину, введення туди одну з браншей( але обов’язково тупу) і розрізають стінку догори до грудини. Потім беруть кровоспинні затискачі, захоплюють ними внутрішні шари стінки живота разом з черевної і відвертають назовні, розкриваючи черевну порожнину.

РОЗТИН ГРУДНОЇ ПОРОЖНИНИ

Розтин проводитися двома розрізами через реберні хрящі по обидві сторони від грудини знизу вгору. Утворився кістково-хрящової клапоть видаляють.

У дрібних лабораторних тварин слід розкрити одномоментно черевну і грудну порожнини для забезпечення вільного доступу до внутрішніх органів, у великих же розкривати тільки ту порожнину, звідки необхідно брати органи для дослідження.

ВЗЯТТЯ МАТЕРІАЛУ

Головною вимогою при взяття матеріалу є: максимальне скорочення строків взяття, мінімальне травмування тканин, створення оптимальних умов для фіксації.

Перше і друге вимога забезпечується хорошим освоєнням техніки умертвіння і розкриття, а також застосуванням дуже гострих ріжучих інструментів (скальпель, бритва, ножиці).

При висіченні матеріалу необхідно максимально дбайливо звертатися з тканинами: ділянки органів, які зазнали травмування (наприклад, при затиску пінцетом) не слід залишати для дослідження.

Сприятливі умови для фіксації створюються правильним вибором розміру фіксованого матеріалу, бо необхідно забезпечити рівномірне і порівняно швидке проникнення фіксуючої рідини на всю його товщину. Тому потрібно вирізати шматочки товщиною не більше 5-10 мм. Поперечні ж і поздовжні розміри не мають такого важливого значення і визначаються завданнями дослідження.

Вирізання шматочків для фіксації є одним з відповідальних етапів у приготуванні якісних мікропрепаратів і дослідницькій практиці і, як правило, повинно проводитися самим дослідником.

Якщо орган складається з ділянок, різних за своєю будовою, необхідно проводити розріз таким чином, що б всі вони потрапили в шматочок, а при не можливості — брати шматочки окремо з кожної ділянки. Наприклад, при взятті шматочків мозку людини або великих лабораторних тварин доводиться вирізати ділянки з певних відділів. З нирки можна вирізати один шматок, що охоплює всю товщину органу від капсули до балії, що забезпечує попадання в нього всіх верств населення. Якщо орган має однорідну будову (більшість залоз, м’язи), то вибір місця для вирізання шматочка не має великого значення.

Якщо необхідно приготувати гістологічні препарати зі стінки кишечнику, січуть потрібний відрізок органу, ополіскують його в ізотонічному розчині хлориду натрію (що б не висохла серозна оболонка), розрізають уздовж (навпроти брижі) і наколюють з допомогою голок на воскову або коркову подушку в розправленому стані слизової оболонкою догори.

Взяття матеріалу з легкого також має деякі особливості, бо легке завжди містить повітря і тканина його плаває, не поринаючи цілком у фіксуючу рідину. Для повного занурення необхідно шматочок органу загорнути в марлю в місці з яким-небудь вантажем.

ФІКСАЦІЯ

Завдання та правила фіксації

Мета фіксації — убити клітку, припинити відбуваються в ній процеси (насамперед ферментативні) і, по можливості, зберегти її прижиттєве будова.

Існує ряд загальних правил фіксації: 1) обсяг фіксуючої рідини повинен не менше ніж у 20 разів перевищувати обсяг фіксованого шматочка тканини; 2) фіксатор повинен мати доступ до фиксируемому матеріалу з усіх боків, з цього на дно посудини кладуть вату або шматочок фільтрувального паперу або підвішують шматочок на нитці; 3) тривалість фіксації залежить від властивостей фіксатора, насамперед від швидкості проникнення фіксатора на тканину; 4) різні фіксатори зберігають різні структурні і хімічні компоненти клітини.

Більшість фіксаторів надає ущільнене дію на оброблюваний матеріал. Розмір досліджуваних шматочків має бути таким, щоб відбулося повне його просочування в оптимальні для даного фіксатора терміни. У середньому для більшості фіксаторів беруть шматочки товщиною 5-10 мм

Розрізняють фіксуючі засоби (прості фіксатори)і фіксуючі суміші (складні фіксатори)

ПРОСТІ ФІКСАТОРИ

1.ФОРМАЛЬДЕГІД (ФОРМАЛІН)

Формалін є найдешевшим і найпоширенішим фіксатором. У чистому вигляді являє, світлу, сильно пахне рідина, що складається з 40% водного розчину формальдегіду. Застосовують переважно у вигляді 10% водного розчину, для чого частина формаліну (тобто 40% розчину формальдегіду) розводять 9 частинами води. Готують розчин обов’язково на водопровідній воді, так як дистильована викликає набухання тканин.

Широке застосування формалін отримав завдяки ряду властивостей:

а) високого ступеня дифузії;

б) здібності ховаю зберігати форму, забарвлення і структуру досліджуваного об’єкта;

в) надавати тривалий фіксує дію (до кількох років), істотно не погіршуючи при цьому якість матеріалу;

г) добре зберігати жири і липоиды.

Висока дифузійна здатність і незначне облягати дію дозволяють формалину досить швидко і глибоко проникати в тканини, що дозволяє фіксувати шматочки органу розміром від 1 см і більше, а при необхідності і досить великі органи цілком.

Термін фіксації тканин у формаліні 24—48год. Звичайний формалін, як правило, містить домішки метилового спирту і мурашиної кислоти, кількість якої збільшується під впливом світла.

При охолодженні формаліну в розчині з’являється каламуть, що осідає у вигляді білого осаду (параформальдегид). Такий осад спостерігається на стінках судини і при випаровуванні формаліну. Тому формалін слід зберігати в темній щільно закривається скляному посуді при температурі не нижче 9°С.

Нейтралізація формаліну. Домішка в формаліні мурашиної кислоти надає розчину слабокислий характер, що небажано при застосуванні ряду методів дослідження (деякі гістохімічні реакції, сріблення розчином нітрату срібла). Спосіб нейтралізації формаліну досить простий: в посудину засипають карбонат кальцію (або карбонат магнію) в такій кількості, щоб на дні утворився шар товщиною 1,5—2 див. Потім наливають формалін, кілька разів енергійно струшують і залишають стояти 24-48 год. протягом цього часу відбувається нейтралізація розчину.

Побічні дії формаліну. Тривале зберігання препаратів в концентрованому розчині формаліну надає тканинам надмірну щільність, утруднює подальшу обробку і ухудшающую якість препарату. Усунути цей недолік можна шляхом приміщення матеріалу на 2 тижні в 1% розчин нітрату срібла або 10% розчин лимонної кислоти. Тривале зберігання в 10% розчині формаліну призводить також до набухання об’єкта, що необхідно пам’ятати при його вимірюванні після фіксації. При фіксації формаліном в препаратах нерідко з’являється темно-коричневий кристалічний осад — результат взаємодії формаліну з перебувають в тканинах гемоглобіном. Його видаляють шляхом приміщення нефарбованих зрізів у 1-5% розчин аміаку або 70% етиловий алкоголь на різні терміни (від 5 хв до 4 год). Потім препарат ретельно промивають і ведуть подальшу обробку.

Слід постійно пам’ятати, що тривале дію пари формаліну сильно подразнює слизові оболонки. Змочування шкіри формаліном надає дубящий ефект, а при повторних частих контактах викликає суху екзему. Тому перед препаруванням формалінові препарати поміщають в слабо аміачну воду (для усунення запаху) і працюють в гумових рукавичках (при можливості під витяжним пристроєм).

2. ЕТИЛОВИЙ СПИРТ

Етиловий спирт. фіксує дія здійснюється за рахунок відібрання у тканин води та коагуляції білків. Незважаючи на ряд негативних властивостей спирту (зморщування клітин в результаті швидкого позбавлення води, розчинення та екстракція жирів і гемоглобіну), він як фіксатор знаходить широке застосування в мікроскопічній техніці. Це пояснюється тим, що етиловий спирт здійснює швидку фіксацію, не вимагає зневоднення тканин перед заливкою в парафін і целлоидин. Будучи хімічно неактивною речовиною, спирт особливо придатний при гістохімічних дослідженнях. У ньому добре зберігаються такі речовини, як муцини, глікоген, сечова кислота, залізо, кальцій, які легко растворимьи в інших фіксуючих рідинах. Частіше застосовують 96% і абсолютний етиловий спирт. Деякі автори рекомендують також концентрації 80 і 90%. Час фіксації залежить від матеріалу: для тонких плівок — 15-30 хв, для шматочків товщиною 3-4 мм — 2-4 ч. У зв’язку з тим, що спирт легше води, вона, экстрагируясь з тканин, опускається на дно. Тому під шматочки досліджуваного матеріалу потрібно обов’язково підкладати товстий шар вати. Надмірне перебування препарату в спирті викликає надмірне ущільнення тканини, що погано відбивається на подальшій її обробці. Для приготування абсолютного спирту 96% спирт наливають на прожарений сульфат міді, позбавлений кристалізаційної води і має вигляд сірувато-білого порошку. Віднімаючи воду від спирту, він набуває синій колір. Зневоднення краще проводити послідовно в двох або трьох посудинах. При цьому в останньому посудині мідь залишається майже безводній і абсолютний спирт над нею може зберігатися довго.

Час фіксації в етиловому спирті-12-24 год, при цьому фіксатор потрібно З рази змінити. Переваги методу: простота, придатність майже для всіх методів фарбування, добра збереженість водорозчинних елементів (глікоген, сечова кислота).

3. АЦЕТОН. останнім часом все більше застосування в гістологічних лабораторіях для гістохімічних цілей знаходить фіксація ацетоном завдяки простоті, можливості швидкої фіксації і збереженню після неї багатьох хімічних сполук, у тому числі активності багатьох ферментів. Недолік методу — порушення тонкої цитологічної структури. Застосовувати слід безбарвний (безводний) розчин. Фіксувати можна як шматочки тканин так і зрізи. Приготовані в криостате зрізи розправляють пензликом на предметному склі, переносять у щільно закритий стаканчик з холодним (5-10%) ацетоном і поміщають у баню з сухим льодом або ж в камеру кріостата. Термін фіксації залежить від толщниы зрізів (в середньому 5-10 хв можна зберігати і кілька днів).

СКЛАДНІ ФІКСАТОРИ

В даний час застосування її в чистому вигляді обмежена. Однак вона служить вихідним розчином для приготування таких поширених фіксаторів, як рідини Ценкера, Орта, Максимова та ін

Біхромат калію 2,5 м

Сульфат натрію 1,0 р.

Вода дистильована 100 мл

Для кращого розчинення біхромату калію рекомендується підігрівати воду.

Фіксація за Навашину—Крилову.

Фіксація цим методом дає хороші результати при фарбуванні ядер і протоплазматических структур залізним гематоксилином.

Склад фіксатора Навашина:

Хромової кислоти 1% р-р 10 мл

Формалін 10% р-н. -10 мл

Вода дистильована -90 мл

Оцтова кислота льодяна -2 мл (додають безпосередньо перед фіксацією)

Шматочки товщиною 5 мм слід фіксувати 4-6 год; потім ретельно промити в проточній воді (24-36 год) для видалення хромової кислоти, залишки якої погіршують забарвлення препаратів. Р. В. Крилов запропонував перед промиванням проводити шматочки через кілька порцій 5-10% формаліну до припинення жовтого забарвлення розчину (формалін витягує хромову кислоту з тканин). Ця процедура скорочує терміни промивання у воді.

Фіксатор ФСУ

(формалін, спирт, оцтова кислота) Бродського.

Рекомендується для вивчення структури тканин і кількісного цитохимического аналізу нуклеїнових кислот. Перевага ФСУ перед фіксатором Карнуа в тому, що формалін пригнічує активність ферментів, що руйнують нуклеїнові кислоти (нуклеази) фіксуються в клітках, завдяки чому кількісно краще зберігаються ДНК і РНК.

Склад і спосіб вживання:

Формалін нейтральний розведений -3 частини

Спирт етиловий 96° -1 чась

Оцтова кислота льодяна -0,3 частини

Шматочки тканин 2 х 2 або 2 х 3 мм; час обробки 1—4ч в залежності від властивостей об’єкта.

Після фіксації шматочки промити водою протягом 12 год або (для цитохімічних цілей) протягом того ж часу трьома змінами 70% спирту. Швидко збезводнити і залити в парафін.

Фіксатор Шабадаша.

Рекомендується як кращий фіксатор для гистохвмического виявлення глікогену (особливо, де його мало, — центральна нервова система).

Склад:

Перший розчин — Спирт етиловий 96%-100 мл Нітрат міді-1,8 р. Нітрат кальцію-0,9 р. Формалін нейтральний-10 мл

Другий розчин — Спирт етиловий 96%-100 мл Нітрат кадмію-2,6 р. Формалін нейтральний -10 мл

Шматочки органу (не більше З х З мм) фіксувати ч у першому розчині, потім перенести в другий розчин на З ч. Промити в трьох-чотирьох змінах 70% спирту за 2 ч. Залити в парафін або целлоидин.

ПРОМИВАННЯ, ЗНЕВОДНЕННЯ І ЗАЛИВКА ГІСТОЛОГІЧНОГО МАТЕРІАЛУ

Успішна фіксація досліджуваного об’єкта — лише перша умова, необхідне для приготування якісних мікропрепаратів. Однак для того, щоб домогтися одержання тонких зрізів (тисячні частки міліметра), зафіксований матеріал необхідно відповідним чином підготувати: зробити досить щільним і в той же час нехрупким. Потрібно надати йому такий стан, щоб при різанні він не кришився і не деформувався, зрізався рівними тонкими шарами. для цього тканину слід звільнити від надлишків фіксатора, знешкодити, просочити і залити який-небудь ущільнюючої середовищем.

Промивання

Мета цієї процедури — звільнити досліджуваний об’єкт від зайвої кількості фіксатора. Спосіб промивання залежить від методики фіксації. Наприклад, після фіксуючих сумішей, що містять пікринову кислоту, дихлорид ртуті, трихлороцтову кислоту, застосовують етиловий спирт різної концентрації. Після фіксації у формаліні, у рідинах, що містять хром, осмиевую кислоту, зазвичай вживають воду. У більшості випадків промивку шматочків тканин виробляють у проточній водопровідній воді. Найбільш зручно це робити, поміщаючи його у скляні або порцелянові сита, які закривають пробкою і опускають у посудину з проточною водою. Пробка забезпечує плавучість, а отвори — постійну циркуляцію води. Якщо шматочок не прошитий ниткою, то етикетку також поміщають в сито. При відсутності сита шматочок загортають у марлю і підвішують за нитку в посудину, наповнену водою. Верх посудини закривають марлею і проробляють в ній невеликий отвір. На водопровідний кран натягують гумовий шланг або прив’язують шнур (смужку бинта), вільний кінець якого пропускають через марлю в посудину і пускають по ньому несильний струмінь води. Середній час промивання 20-24 год.

Починаючи з цього етапу і до самого кінцевого моменту виготовлення гістологічного препарату слід строго дотримуватися правила поступового впливу застосовуваних речовин на досліджувані тканини. Після промивання шматочки піддають подальшому ущільнення шляхом зневоднення у спиртах зростаючої концентрації. Для проведення процедури готують необхідну кількість бюксов або стаканчиків з притертими кришками,(можна використовувати не великі банки з кришкою, що загвинчується ) этикетируют їх і заливають спиртами: 50, 60, 70, 80 і 96% (по два стаканчика), 100% (два стаканчика). Такий послідовний ряд судин отримав назву гістологічної батареї.

Спирти потрібної фортеці готують заздалегідь за спеціальною таблицею розведення з 96 або 95 % етилового спирту

Короткий опис статті: гістологія серця Мікроскопічна техніка в біології і медицині www.labx.narod.ru мікротом, мікроскоп, гістологія, гістологічна, патогистология, гематоксилін, еозин, фіксатор, формалін,

Джерело: Гістологічна техніка

Також ви можете прочитати